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南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频

体外受精技术资料 2021-01-14

下述操作有视频资料,仅供参考

链接:https://pan.baidu.com/s/1XCcKQ2J81pGZS0a3Daf2vg
提取码:1234


  试剂耗材准备

1 PMSG 9 200ul移液器
2 hCG 10 灭菌眼科剪2把
3 1mL 注射器 11 灭菌眼科镊2把
4 M2培养液 12 体视显微镜
5 KSOM培养液 13 倒置显微镜
6 矿物油 14 二氧化碳培养箱(37℃, 5% CO2, 95% air)
7 35mm胚胎培养皿 15 胚胎转移用口吸管
8 独立包装一次性塑料巴氏吸管 16 1 .5mm毛细玻璃管

  1.超数排卵

●每只雌鼠(8-12周龄)注射PMSG 5-10IU(0.1-0.2ml)。(一般在14:00 —18:00之间注射)。
●48小时后注射hCG 5IU(0.1ml)。
●在注射hCG后14-16h进行受精,约早9点-11点杀鼠取卵。

小鼠腹腔注射方法

抓住小鼠的颈部,靠近耳朵。要尽量多抓皮肤,以便小鼠不能转头,把小鼠尾巴缠绕在小手指上。用1ml注射器呈45°斜刺进腹腔,注意不要刺伤膈和其他器官,回吸一下确认没有血液后注射液体,等待片刻后拔针,以免液体渗漏出来。请尽量穿戴防咬手套注射,如被咬伤应及时就医。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图1)

  2.培养皿准备

注射hCG当日准备下述培养皿过夜平衡。每制备2个皿即应立即加入矿物油覆盖微滴,避免培养液中的水分蒸发,影响渗透压。培养皿盖应注明实验名称缩写(皿盖侧面也需标注),日期及培养液名。当一个实验的皿超过2个,应在皿盖上注明XX1、XX2等表明顺序。培养皿底部应依次标注胚胎序号。

●HTF受精皿准备。
注意:用于精卵结合,在超净工作台内制备,注意无菌操作。需要多准备一个清洗皿。
步骤1:用灭菌200ul枪头(货号:)吸取200ul HTF培养液做滴。
步骤2:从侧壁缓缓加入矿物油约2ml直至没过培养滴。请勿直接对着培养液加油,防止将滴冲散。
步骤3:将培养皿置于二氧化碳培养箱中(37℃, 5% CO2 ),过夜平衡。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图2)

●精子获能皿准备。
用于附睾精子获能,在超净工作台内制备,注意无菌操作。HTF液或TYH液,制作步骤同上。
●KSOM培养皿准备。
用于培养受精卵至囊胚期,KSOM培养液中已含有丙酮酸和葡萄糖,中途不需要换液。培养皿可做10个滴,每个滴30ul,每个滴放10枚胚胎。在皿底反面用记号笔给滴编号。制作步骤同上。

  3.精子获能

●取卵当日先杀雄鼠取附睾尾部精子获能。快速颈椎脱臼法处死雄性小鼠(图1):把小鼠放在鼠笼上面,使它前爪抓住笼子上面的钢丝条,紧紧压住它的颈部,同时水平向后拉伸尾部,使其断颈。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图3)  

图1快速颈椎脱臼法处死小鼠示意图

●将小鼠放在纸上,用75%的乙醇消毒腹部。
●用手指捏住皮肤并用眼科弯剪在皮肤上做一小切口。然后用力将皮肤拉到头部,完全暴露腹部。然后剪开腹膜,完全暴露内脏器官。在腹部的最下端位置可见大量脂肪层,用镊子夹着脂肪层轻轻向小鼠头方向牵引能看一睾丸被牵出。

●成年小鼠的睾丸大约有一粒黄豆大,在睾丸下方一点与睾丸相连的位置,能看到白色附睾,能看到其内有许多曲精小管(图2)。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图4)

图2 雄鼠睾丸结构示意图

●找到睾丸后附睾后,迅速用眼科剪和眼科镊将附睾及输精管剪下置于精子获能滴中,用注射器针头将附睾尾划破,待精子溢出后,培养箱孵育10min,取出体视镜下观察,精子扩散后,放入培养箱继续孵育50min后可用。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图5)

图3示意图

  4.取卵

●精子获能后立即用M2培养液在培养皿内做数个200ul捡卵滴,矿物油覆盖,置于37℃加热平板上加热30分钟。M2培养液含有HEPES,可以在二氧化碳培养箱外维持pH值稳定,因此只需要加温即可。

●精子获能50分钟后,快速颈椎脱臼法处死雌性供体小鼠。

●将小鼠放在吸水纸上,用75%的乙醇消毒腹部。

●用第一套眼科镊捏住皮肤并用眼科剪在皮肤上做一小切口。然后用力将皮肤拉到头部,完全暴露腹部。然后用第二套器械剪开腹膜,完全暴露内脏器官。将肠管拉向一侧后即可在腹腔中见到两侧的子宫和相连的卵巢。卷曲的输卵管在卵巢和子宫之间(图1)。(注意不能用剪开皮肤的眼科剪和眼科镊去剪腹膜和输卵管,防止出现污染)。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图6)

图1 小鼠腹腔解剖示意图

●用眼科镊夹住子宫将其提起,这有利于将子宫和腹膜分离开。用眼科剪在膜上刺破一小口,然后将子宫分离下来。仍用镊子夹住子宫,用显微剪在卵巢和输卵管之间剪开。切口必须尽可能的接近输卵管。将镊子移到输卵管处夹住输卵管,在输卵管和子宫之间在剪一刀(图2)。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图7)

图2  输卵管分离示意图

●将输卵管放入M2捡卵滴之间的矿物油中。将有输卵管的皿移至体视镜下,用两个1ml注射器针头配合切开输卵管壶腹部,释放COC,将COC牵引至捡卵滴内(图3)。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图8)


南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图9)

图3 捡卵示意图

  5.授精

●用口吸管和灭菌1.5mm毛细玻璃管将COCS转移到HTF清洗皿内,反复吹打,尽量洗去HEPES。

●转移至HTF受精皿内,每个滴放2团COCS。

●用移液枪从精子获能皿中吸取3ul精子加入授精滴内。精子密度1-5×10^6为宜(以放入培养箱中10min后能看到COC被精子打散,精子能推动COC运动即可)。

●整个受精过程以5min内完成为宜(杀鼠到受精入箱)。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图10)

●受精6h后,用1.5mm毛细玻璃管拉制的直径100um吸管将受精卵从受精滴中移入KSOM培养皿液滴中,反复吹打,直至透明带上基本无精子残留,移到一个新滴中继续培养4h,观察原核形成情况,以形成原核和排出PB2为受精标志,计算受精率。

南京爱贝生物的小鼠体外受精操作步骤及操作视频(图11)