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IVF protocol

体外受精技术资料 2021-01-14

  实验试剂

MEM+BSA+10%FBS 自己配置:10%为体积分数,如将1.5mlFBS成品加入13.5ml的MEM+BSA
矿物油 sigma(M8410-100ML)
胚胎培养液KSOM millipore(MR-020P-F)
透明质酸酶(Hyaluronidase) sigma(H4272),30mg干粉(0℃以下储存)加入3ml M2溶液,配制成10mg/ml的高浓度储存液(10X),取出100ul的10X储存液加入900ul M2 培养液即为1mg/ml的工作液,分装成100ul/管,使用时每只母鼠50ul,液体全部-20℃保存
培养条件 37℃,5%CO2,5%O2,90%N2

  实验步骤

●第一天:晚9点供卵雌鼠注射PMSG,3W小鼠5UI/只,2M以上小鼠10UI/只。已提前配制好***UI/ml的PMSG和hCG。
●第三天:46-48h后约晚7点注射hCG,3W小鼠5UI/只,2M以上小鼠10UI/只。
●第四天:在注射hCG后14-16h进行受精,最好不超过15h,约第四日早9点-11点杀鼠取卵。
分类 容量 试剂 是否覆油 备注
附睾采集皿 2.5ml MEM+BSA
精子获能皿 900ul MEM+BSA 覆油 受精前1h
卵子采集皿 2.5ml MEM+BSA+10%FBS
卵子清洗皿 2.5ml MEM+BSA+10%FBS
受精皿 490ul MEM+BSA 覆油
1cell清洗皿 200ul MEM+BSA 覆油 受精后4-6h
发育培养皿 50ul KSOM 覆油 受精后1D,提前过夜覆盖矿物油平衡
注意 1.如果不需要消化卵丘细胞, 可不加FBS。FBS是用来保护透明带,防止其硬化 !!!1cell清洗皿要做俩个滴
2.除KSOM培养皿外,均在操作前提前30m-1h预平衡。因覆盖石蜡油后预平衡易产生气泡,可先预热试剂再覆油
●准备获能精子:因精子需提前获能一小时,需要提前一个多小时杀F1公鼠。在注射hCG后12-13h处死雄鼠,迅速分离输精管和附睾尾,尽可能取出脂肪和血管,用镊子和30号针头切附睾尾6-7下,放入精子获能皿,置于37℃温育1h。
●准备卵细胞:提前30m准备卵子采集皿、卵子操作皿,剪取卵巢、输卵管和小部分子宫,镜下用注射针头切出2个输卵管,挑入50ul(1mg/ml)的透明质酸酶滴,用针头切开壶腹部,挤出排出的卵丘细胞团,在酶滴中消化1-2min,直至卵丘细胞完全脱落,然后用口吸管将卵转入卵子清洗皿中洗去透明质酸酶和杂质。记录卵的时期及个数,见表1。
●受精:将事先准备好的490ul受精滴加入10ul精子,并将含第二极体的卵转入受精滴,立即放入培养箱,开始计时。
●清洗1cell:4-6h观察并记录原核数量,/将所有卵或受精卵转移至新的1cell清洗皿(200ul),石蜡油覆盖。
●观察:受精24h后观察并记录2-cell的数量,转入新的50ul KSOM培养液滴中,此后不再换液。每隔24h观察并照相,记录生长状态。
取卵记录表格1:
ID GV或GVBD(含生发泡) M II(含第二极体) Total
1
2
受精卵发育表格2:
ID 4-6h 8h 24h 48h 72h 96h 120h 比例
原核 1-cell 2-cell 4-cell 8-cell 囊胚 囊胚孵化 各期数/2-cell数
第一天 第二天 第三天 第四天 第五天
1
2