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小鼠卵母细胞体内成熟及体外受精(IVF)

体外受精技术资料 2021-01-14

  实验材料

雌性和雄性小鼠 昆明白,6-8周龄,12光照,温度20-25℃,自由采食和饮水
耗材与设备 1ml注射器,眼科剪,眼科镊
试剂 PMSG/ECG,HCG,体外受精液HTF,KSOM-AA胚胎培养液

  培养皿准备(IVF前1天下午准备并在培养箱里平衡过夜)

●鲜精采集皿:1ml HTF(35mm国产)。
●卵子采集皿:1ml HTF或HEPES-KSOM(35mm国产)。
●体外受精皿和清洗用培养皿:60mm(进口)皿----上部做受精液滴(HTF),下部做清洗液滴(HTF)。
●发育培养皿:35mm(进口)皿,培养密度:10embryo/40ul。

  操作步骤

体内成熟的MⅡ期卵母细胞收集准备
●步骤一:6-8周龄雌鼠腹腔(IP)注射10IU PMSG(适宜时间:6-7pm)。
↓48h later
●步骤二:腹腔(IP)注射10IU HCG。
↓13-18h later
●步骤三:雌鼠颈椎脱臼致死,75%酒精消毒背部,从背部剪下两侧卵巢及输卵管迅速置于预热的HFM。
●步骤四:在体视镜下用1ml注射器(1号针头)将输卵管刺破,释放出COCs。
●步骤五:用口吸管将COCs置于100ul 0.1%Hya 消化去除卵丘细胞(体视镜下观察)。
●步骤六:MII期卵母细胞经HFM液滴洗涤3次,移入HTF受精液中,置于CO2培养箱培养1h备用(10embryo/50ul)。
采集小鼠精液进行IVF
●步骤一:MII期卵母细胞准备好之后,颈椎脱臼致死雄鼠。
●步骤二:75%酒精消毒背部,剪开背部取出附睾尾及输精管迅速置于预热的获能液HTF中,剪5-7下,使精子上浮并获能30min~1h。
●步骤三:用移液器取10~20ul(依精液浓度而定)精液于受精液中共同孵育6小时。
●步骤四:倒置显微镜下挑选排出PB2 或有2PN的受精卵经KSOM培养液洗涤几次,移入KSOM培养液(平衡4h以上)继续培养。此时计为0h,统计受精率。
●步骤五:观察,记录体外受精和发育情况。