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小鼠体细胞核移植(克隆)

体外受精技术资料 2021-01-14

小鼠体细胞核移植(克隆)

1、化学去核(化学诱导和化学辅助去核)

小鼠超数排卵及GV期卵母细胞体外成熟(IVM

 ICR雌鼠(6-8周龄)腹腔(IP)注射10IU PMSG(时间:8:00am

                                   46-48h later

     颈椎脱臼致死小鼠,取双侧卵巢于H-CZB中,30G注射器刺破大的有腔卵泡

  ↓

收集COCs/NO并在H-CZB液滴中洗涤几遍,移入IVM(平衡4h以上)培养5h,培养密度:10-20/50μl

  卵母细胞去核和透明带消化

体外成熟5h后,机械吹吸COCs去除卵丘细胞(没有用Hya消化去除卵丘细胞)

挑选GVBD卵母细胞(体视镜能观察到GVBD?)移入DC(0.4μg/ml)+KSOM培养2h

移入DC(0.4μg/ml)+CHX(50μg/ml)+ KSOM培养12h (时间太长,尝试把时间缩短为3h)

将排出PB1的卵母细胞移入Pronase(5mg/ml) 消化约2min去除透明带

KSOM液滴中洗涤3遍,移入KSOM液滴375CO2培养(15h)待用

  粘合和融合

去核卵母细胞在KSOM中培养15h后(尝试把时间缩短为05h

卵胞质移入PHA (10μg/ml) + H-CZB粘合液滴中,372min

移入H-CZB体细胞(卵丘细胞)液滴中,拨动卵胞质使其与体细胞粘贴,形成卵母细胞-体细胞复合体

卵母细胞-体细胞复合体移入融合液(无Ca中平衡2min, 立即转入电击槽电极间

交流电5v/mm,3μs对复合体进行排队(10/批),接触面平行于两电极间

施加直流电脉冲(92V/mm, 70us, 2次),静置1min

复合体在KSOM液滴中洗涤2遍,快速移入KSOM液中培养2030min后检查融合情况

将成功融合的复合体移入Ca2+-free CZB+ CB(5μg/ml)中培养3h(防止电刺激后排出PB2极体,促进体细胞的重编程)

化学激活

将融合后培养3h的复合体移入激活液[Ca2+-free CZB+ SrCL2(10 m M/L)+CB(5μg/ml)]培养6h

无透明带重构胚体外培养

激活后的重构胚在KSOM液滴中洗涤2遍后,移入WOW体系培养

10microwells/well, embryo density: 10/500μl

2、手工去核

小鼠超数排卵及MⅡ期卵母细胞收集

ICR雌鼠(6-8周龄)腹腔(IP)注射10IU PMSG(时间:5:00pm

46-48h later

腹腔(IP)注射10IU HCG

16-18h later

颈椎脱臼致死小鼠,取双侧卵巢于H-CZB中,在体视镜下用1ml注射器(1号针头)将输卵管膨大部刺破,COCs团块和NO(自然裸卵)释放出来

COCs移入0.1%透明质酸酶静置2min,去除卵丘细胞,收集卵母细胞和卵丘细胞并在H-CZB液滴中洗涤几遍后,移入H-CZB待用

  卵母细胞透明带部分消化和手工去核

挑选排出PB1的卵母细胞置于H-CZB液滴中

将排出PB1的卵母细胞移入Pronase(5mg/ml)消化部分透明带(要保证消化后极体还存在),注意控制消化时间(20/次)

快速将透明带部分消化的卵母细胞移入体外操作液CB(5μg/ml)+ H-CZB液滴中,用胚胎分割刀沿PB1方向将卵母细胞1/3切除,卵胞质移入H-CZB液滴待用

将切割后的卵胞质移入Hoechst33342/33258(5μg/ml)染色5-10min,UV光下观察记录去核率(可以省略)

  粘合和融合

手工去核卵胞质移入PHA (10μg/ml) + H-CZB粘合液滴中,37℃2min

移入H-CZB体细胞(卵丘细胞)液滴中,拨动卵胞质使其与体细胞粘贴,形成卵母细胞-体细胞复合体,再将复合体转入H-CZB液滴中,等待融合

卵母细胞-体细胞复合体和另一半卵胞质移入融合液(无Ca中平衡2min10/批)

迅速将复合体和另一半卵胞质移置融合槽的北面和南面,交流电5v/mm,3μs对复合体进行排   队(10/批),接触面平行于两电极间,同时将另一半胞质与复合体粘贴构成三明治形状(当心拨掉体细胞),最后,施加直流电脉冲(92V/mm, 70us, 2次),静置1min

将复合体快速移入KSOM液滴中洗涤几遍,并培养1-3h(促进体细胞核重编程),检查融合情况

化学激活

将培养1-3h成功融合的重构胚移入激活液[Ca2+-free CZB+ SrCL2(10 m M/L)+CB(5μg/ml)]培养6h(开始记录培养的日期)