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小鼠胚胎实验技术实验讲义

体外受精技术资料 2021-01-14


实验一:小白鼠生殖系统解剖

 

实验目的、原理:了解小白鼠生殖系统的结构、位置和名称,为下面的实验做准备。

实验内容和方法:

1.         手术器械消毒;

2.       颈椎脱臼处死小鼠;

3.       酒精棉球腹壁消毒;

4.       腹部皮肤横剪口;

5.      雄性小鼠:将消化道拨向上方,剪断直肠。提生殖脂肪,将精巢(睾丸)   从阴囊提出,观察精巢、附睾头、附睾尾等结构。从阴茎开始剥离整个生殖系统。

6.       雌性小鼠;将消化道拨向上方,观察阴道、子宫颈、子宫体、子宫角、输卵管和卵巢等结构。

 

 

 

实验二:小鼠阴道涂片的制作与观察

 

实验目的:掌握小鼠性周期的鉴定方法。

实验原理:在大鼠、小鼠、豚鼠和中国地鼠等几种啮齿类动物,正常的性周期的不同阶段阴道粘膜发生比较典型的变化。因此根据阴道涂片的细胞学变化,可以推断卵巢的周期性改变,鉴定性周期。

实验内容和方法:

1.      取样:左手拇指和食指捏住动物尾巴,将其放在笼子的铁丝盖上,等前爪抓住铁丝网时,提起尾巴,抖掉毛皮上粘的锯末及粪便等脏物,用其余三指轻压其后腰背部,翻起尾巴露出阴道口,先观察外阴部的变化,然后用右手持小滴管吸少量生理盐水滴入阴道口。要尽量不让滴管触及阴道口,以免检查次数多了引起炎症。当小鼠稍放松尾部及腰部时,生理盐水被吸入阴道,稍后,三指轻压腰部,生理盐水既流出来,吸入滴管,滴在载玻片上。

2.     镜检:在显微镜下直接观察细胞的形态,鉴定发情周期。具体鉴定方法如下:

发情前期:主要由有核上皮细胞组成,偶有少量的角质化细胞,没有白血球。

发情期:主要由角质化细胞构成,其中有可分为两个期和Ⅲ,Ⅱ期的角质化细胞较小,偶尔伴有少量有核细胞。Ⅲ期的角质化细胞较大,并形成团块或成片。

发情后期:除了角质化细胞,还有白血球,有时也有少量有核上皮细胞。

发情间期或休情期:主要有白血球,有时还有少量的角质化细胞或者有核上皮细胞。

   

 

 

实验三:雄鼠的结扎    

 

实验目的及原理:

切断雄鼠的输精管,使其不能输送精液,但仍然具有交配能力。结扎过的雄鼠与雌鼠交配后,雌鼠接受交配刺激后,在没有受胎的情况下形成功能性黄体,为胚胎移植做准备。

实验内容和方法:

1.       小鼠麻醉。

2.       小鼠的固定。

3.       剪毛。

4.       消毒(器械创布用1%的新洁尔灭消毒,动物皮肤用酒精棉球消毒)。

5.       腹部开口,先皮后腹壁肌肉。

6.     用镊子沿腹壁肌肉向下捏住生殖脂肪,拉出输精管,用烧烫的解剖针将输精管烫断,将拉出来的组织用镊子轻轻放回腹腔,同样处理另一侧输精管。

7.       缝合,腹壁肌肉采用连续缝合,皮肤采用非连续缝合。

8.       将小鼠置于台灯下(温暖处)使其尽早苏醒。

 

 

 

实验四:小鼠的超排处理

 

实验目的及原理:

在哺乳动物正常的生殖活动中能够被利用的卵母细胞的数量只占其实际潜在部分的1/10001/10000的样子。根据生殖激素在雌性动物性周期中的作用原理,可以应用某些激素和激素类物质人为干预雌性动物生殖生理过程,从而使动物按照人们预定的计划和时间发情,并排出比自然排卵多几倍或几十倍的成熟卵子。

实验内容和方法:

1.       6周龄的昆明小白鼠,于下午5时腹腔注射PMSG7.5 iu ,以促进小鼠的更多的卵泡发育。

2.       48小时后,腹腔注射HCG7.5 iu ,以促进发育成熟的卵泡排卵。

3.       注射完HCG后,雌雄小鼠1:1合笼,次日晨检栓,出现阴道栓的证明交配成功。

 

 

 

实验五:小鼠冲胚及早期各发育阶段的观察

 

实验目的及原理:

练习从输卵管、子宫回收早期胚胎的实验操作,观察不同发育阶段的小鼠胚胎的形态。

实验内容和方法:

1.       以见栓当天为见栓第一天。于见栓第一天上午9时颈椎离断处死超排处理鼠,解剖取输卵管,用注射器吸取PBS液在显微镜下冲洗输卵管,显微镜下观察冲出来的原核期胚胎

2.       于见栓第二天上午9时,处死见栓鼠,冲洗输卵管,观察2~4细胞胚胎

3.       于见栓第三天下午3时,子宫冲胚,观察8细胞期胚胎

4.       于见栓第四天下午3时,子宫冲胚,观察观察桑椹胚及囊胚

 

实验六:胚胎冷冻及解冻

 

实验目的及原理:

练习胚胎冷冻的一般操作,冷冻保存的胚胎用于下一步的胚胎移植实验。胚胎经化学冷冻保护剂脱水处理后,可放入液氮(—196)中长期保存。解冻复苏后可用于胚胎移植。

实验内容和方法:

1.       超排处理

2.       于见栓第四天下午3时,子宫冲胚,回收囊胚。

3.       胚胎冷冻及解冻。

采用OPS(Open Pulled Straw)法进行冷冻和解冻。

冷冻过程:将待冻胚胎移入HMHolding Medium,TCM199+20%FCS)中洗两遍,然后移入冷冻液VS1TCM199+20%FCS+10%DMSO+10%乙二醇)中,平衡2min,然后用加样器吸取1-2μl VS1,同时吸入胚胎,放入冷冻液VS2(TCM199+20%FCS+20%DMSO+20%乙二醇)中,用加样器迅速混匀,然后吸取胚胎连同2μl VS2,放在另一皿中,做成含有胚胎的2μl VS2小滴,用事先拉好的冷冻细管,通过毛细现象将2μl VS2连同胚胎一同吸入。胚胎从进入VS2装管完成到投入液氮要控制在25s以内,若装管提前完成,待胚胎在VS2中停留25s后,立即投入液氮。

解冻过程:从液氮中取出OPS管,甩掉液氮后将细端插入解冻液1TCM199+20%FCS+0.3MSuc)中,用手指堵住粗端,利用手指温度驱使胚胎进入解冻液中,胚胎在解冻液1中停留5 min,然后移入解冻液2TCM199+20%FCS+0.15M Suc)中,停留5分钟,移入HM停留3-5 min,鉴定胚胎形态,移入CZB培养液小滴中进行培养。冷冻解冻过程均在37℃条件下完成。

 

 

 

 

 

实验七:胚胎解冻移植

 

实验原理及方法:

掌握小鼠的胚胎移植方法。原理:选择8~12周龄的未经产雌鼠,与结扎了输精管的雄鼠合笼,见栓第四天时,将前面实验中冷冻的第四天囊胚解冻,移入假孕处理第四天小鼠的子宫内,此时,供受体的发育状态基本同步。胚胎在受体子宫内可着床发育,产出正常子鼠。

实验内容及方法:

1.       雄鼠的结扎:方法同实验三。

2.       雌鼠的假孕:将选好的受体鼠与结扎了输精管的雄鼠合笼,见栓,用见栓第四天的雌鼠作为受体鼠。

3.       胚胎解冻:方法同实验六。

4.        胚胎移植:将见栓第四天的假孕雌鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉,注射剂量同雄鼠结扎时的注射剂量。然后在背部肋缘稍后的部位剪毛、消毒,剪开皮肤和肌肉,将卵巢和子宫角牵引出,用牙科针头在子宫角上刺一小孔,刺入子宫腔内。将胚胎吸入玻璃吸管内,吸入的液体要尽量少。将吸管前部穿入子宫角刺开的小孔内,轻轻插入子宫腔,将胚胎缓慢吹入。移植完成迅速将手术部位缝合,术后小鼠应注意保温,待其复苏后放回动物室